Станция Visium CytAssist, Accessory and Training Kit для переноса срезов ткани на слайды Visium, 12 мес. гарантии, арт. 1000441, 10x Genomics

Описание

Станция Visium CytAssist, Accessory and Training Kit для переноса срезов ткани на слайды Visium, 12 мес. гарантии, арт. 1000441, 10x Genomics
Технология Visium предназначена для анализа распределения экспрессионных профилей клеток в пространстве. Это совершенно новый подход к исследованию динамики молекулярных процессов в биологических образцах.
Возможна апробация.

Компоненты системы Visium

• Слайды для визуализации образцов и захвата транскриптов (приобретается отдельно: арт 1000187, 1000184),
• Реагенты для захвата транскриптов и синтеза кДНК,
• Слайды и реагенты для оптимизации условий пермеабилизации (приобретается отдельно: арт 1000193),
• Реагенты для подготовки РНК-библиотеки (3’) (приобретается отдельно: арт 1000215),
• Программное обеспечение для биоинформатической обработки данных.

Описание технологии Visium

Общая схема подготовки NGS-библиотеки для анализа пространственной экспрессии генов с помощью технологии Visium выглядит следующим образом.

Рис. 1. Общая схема технологии Visium.

Протокол начинается с подготовки 4-х срезов ткани толщиной 10-50 мкм и их размещении на специальных слайдах в 4-х зонах захвата транскриптов.

Рис. 2. Устройство слайда Visium для анализа пространственной экспрессии генов.

Каждая такая зона состоит из 5 000 точек захвата транскриптов. Точка захвата представляет собой группу олигонуклеотидов, закрепленных на подложке. Диаметр каждой точки – 55 мкм, а расстояние между ними – 100 мкм. В зависимости от типа ткани и толщины среза на одну точку может приходиться 1-10 клеток.

Последовательность олигонуклеотидов включает в себя адаптер R1 (стандартный адаптер TruSeq), баркод Spatial, метку UMI и поли-dT-хвост. Баркод Spatial уникален для каждой точки захвата транскриптов.

После размещении среза ткани на слайде ее фиксируют и окрашивают гематоксилин-эозином. Подготовленный препарат визуализируют с помощью микроскопа и фотографируют.

Рис. 3. Микроскопия и фотографирование подготовленного препарата срезов ткани.

Затем слайд вставляют в специальный адаптер, имеющий отверстия напротив зон захвата. Таким образом образуются лунки, дном которых выступают срезы тканей и куда можно вносить реагенты.

Рис. 4. Слайд Visium в адаптере.

Следующий этап протокола – пермеабилизация клеток. Ее выполняют путем добавления в лунки специальных ферментов и инкубации адаптера со слайдом при 37°C. При этом мРНК покидают образец и связываются с поли-dT-хвостами олигонуклеотидов зон захвата.

Рис. 5. Пермеабилизация клеток среза.

Далее следуют этапы синтеза кДНК методом обратной транскрипции с переключением матрицы, денатурации и удаления мРНК, синтеза второй цепи кДНК, денатурации и переноса второй цепи кДНК в пробирки.

Рис. 6. Синтез первой и второй цепи кДНК на слайде Visium.

На последней стадии вторую цепь кДНК используют для подготовки NGS-библиотек, включающую в себя:

• Оценку качества кДНК,
• Амплификацию кДНК,
• Фрагментацию / восстановление концов / 3'-аденилирование концов,
• Лигирование адаптеров,
• Индексирующую ПЦР,
• Контроль качества библиотеки.

Рис. 7. Структура фрагментов библиотеки, подготовленной по технологии Visium.

Готовую библиотеку можно секвенировать на любой платформе Illumina®. Глубина прочтений должна составлять не менее 50 000 пар ридов на одну зона захвата мРНК (то есть на один баркод Spatial). Режим прочтения – 28 x 120 н.п.

Оптимизация условий пермеабилизации в протоколе Visium

Перед тем как приступать к исследованию новых типов тканей, рекомендуется оптимизировать длительность ферментативной пермеабилизации для максимально эффективного захвата мРНК. Для этих целей 10x Genomics разработал специальный набор слайдов и реагентов.

Слайды для оптимизации имеют уже 8 зон захвата мРНК, но размещают на них всего 7 срезов ткани. Одна зона предназначена для положительного контроля, в качестве которого используют референсную мРНК. Закрепленные на подложке олигонуклеотиды не содержат баркодов и состоят из одного поли-dT-хвоста.

После стандартной подготовки, окраски, фиксации и фотографировании срезов ткани на слайде его вставляют в адаптер и приступают к подбору условий пермеабилизации.

Для этого в лунку без среза ткани для положительного контроля добавляют референсную РНК, в лунку со срезом для положительного контроля не добавляют ничего. В остальные же лунки через определенные промежутки времени добавляют ферментативную смесь для пермеабилизации, инкубируя слайд при 37° C.

Далее лунки промывают и добавляют в них реакционную смесь для обратной транскрипции, которая содержит дЦТФ, меченный флуоресцентным красителем Cyanine 3. И в ходе обратной транскрипциии синтезируется флуоресцентно меченная кДНК.

На следующем этапе с помощью ферментов со слайдов удаляют ткани и методом флуоресцентной микроскопии оценивают эффективность захвата мРНК при разной длительности пермеабилизации. Наилучшие условия используют в дальнейшем при работе с опытными образцами.

Рис. 8. A - Срезы ткани на слайде Visium для оптимизации условий пермеабилизации.B - Оценка зависимости эффективности захвата мРНК от длительности пермеабилизации: Pos и Neg – положительный и отрицательный контроли; 3, 6, 12, 18, 24 и 30 – длительность пермеабилизации в минутах.

Обработка данных секвенирования библиотек пространственной экспрессии Visium

Первичную и вторичную обработку данных секвенирования выполняют с помощью бесплатного программного обеспечения Space Ranger и Loupe Browser.

ПО осуществляет выравнивание полученных ридов и фотографий, сделанных на этапе подготовки препарата. Баркод Spatial помогает определить, в какой точке был захвачен тот или иной транскрипт.

Результаты обработки можно вывести в виде наглядных отчетов. Они содержат информацию об общем числе точек, в которых произошел захват, числе ридов, приходящихся на одну точку захвата, числе генов, экспрессирующихся в точках захвата, и многие другие показатели.

Рис. 9. Пример отчета, сформированного программным обеспечением Space Ranger.

Также можно визуализировать пространственную экспрессию конкретных генов и кластеризировать точки захвата на основании экспрессионных профилей нескольких генов.

Рис. 10. Результаты анализа пространственной экспрессии генов в головном мозге мыши по технологии Visium: A – корональный срез, окрашенный гематоксилин-эозином, B – пространственное распределение меток UMI, C – пространственное распределение экспрессии генов, D – пространственная кластеризация экспрессии 8 генов.

Рис. 11. Пространственная экспрессия генов Hpca (A) и Selenow (B) в головном мозге мыши. Транскрипты обоих генов хорошо представлены в гиппокампе (белый прямоугольник), что согласуется с известными паттернами экспрессии.

Типы тканей, совместимые с технологией Visium

Технология совместима с различными тканями человека, мыши и крысы. Их фиксацию можно выполнять метанолом.

Ниже перечислены типы тканей, совместимость которых с системой Visium была валидирована:

Ткань	Толщина среза	Ткань	Толщина среза
Человек		Мышь
Головной мозг (мультиформная глиобластома)	10 мкм	Головной мозг (здоровый)	10 мкм
Грудь (здоровая)	10-20 мкм	Глаза (здоровые)	10 мкм
Грудь (инвазивная протоковая карцинома)	10-20 мкм	Сердце (здоровое)	10 мкм
Грудь (инвазивная лобулярная карцинома)	10-20 мкм	Почки (здоровые)	10 мкм
Сердце (здоровое)	10 мкм	Толстый кишечник (здоровый)	10 мкм
Почки (здоровые)	10 мкм	Печень (здоровая)	10 мкм
Почки (нефрит)	10 мкм	Легкие (здоровые)	10 мкм
Толстый кишечник (колоректальный рак)	10-20 мкм	Яичники (здорове)	10 мкм
Легкие (папиллярная карцинома)	10 мкм	Квадрицепс (здоровый)	10 мкм
Лимфоузлы (здоровые)	10 мкм	Тонкий кишечник (здоровый)	10 мкм
Лимфоузлы (воспаленные)	10 мкм	Селезенка (здоровая)	10 мкм
Яичники (опухоль)	10 мкм	Желудок (здоровый)	10 мкм
Селезенка (воспаленная)	10 мкм	Семенники (здоровые)	10 мкм
Крыса		Щитовидная железа (здоровая)	10 мкм
Головной мозг (здоровый)	10 мкм	Язык (здоровый)	10 мкм
Сердце (здоровое)	10 мкм
Почки (здоровые)	10 мкм

Общие характеристики